Full Text

Введение Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний в мире, занимающим 3-е место в структуре смертности от злокачественных новообразований [1]. Ежегодно в мире регистрируется около 1 361 000 новых случаев КРР и около 694 600 пациентов ежегодно погибают от данной патологии. В экономически развитых странах на КРР приходится примерно 9-14% случаев онкологических заболеваний. В 2016 г. в Республике Казахстан зарегистрировано 3158 больных КРР, 1484 умерли. В структуре смертности рак прямой кишки и рак ободочной кишки заняли 8-е и 5-е ранговые места соответственно [2]. Одним из наиболее значимых событий в молекулярном патогенезе КРР является активирующая мутация в онкогене KRAS. Встречаемость мутации KRAS в опухолях толстой кишки, по данным разных авторов, колеблется от 30 до 50% [3-6]. Вариации частоты мутаций KRAS принято объяснять популяционными различиями образа жизни, характера питания, проживания в различных регионах мира [7]. При IV стадии или метастатической форме КРР основным методом лечения является химиотерапия в сочетании с таргетной терапией в зависимости от статуса KRAS, назначение которой, по данным последних рандомизированных исследований, приводит к улучшению результатов лечения и увеличению выживаемости больных на 8-10 мес, по сравнению с только химиотерапией. Для определения контингента больных, нуждающихся в таргетной терапии, необходимым условием является определение статуса KRAS. Наличие у пациентов с КРР дикого типа KRAS служит основанием для проведения таргетной терапии ингибиторами тирозинкиназного домена (TKI) рецептора EGFR. Целью исследования стала оценка частоты встречаемости дикого и мутированного типа гена KRAS в различных регионах республики для определения пациентов, нуждающихся в таргетной терапии. Материалы и методы Материалом исследования явился фиксированный в формалине, заключенный в парафин опухолевый материал 332 пациентов с диагнозом КРР, проходивших лечение в онкологических диспансерах, онкологических центрах и в Казахском научно-исследовательском институте онкологии и радиологии (КазНИИОиР) за период 2010-2014 гг. После морфологической оценки качества исследуемого материала в лаборатории молекулярной генетики было проведено молекулярно-генетическое исследование по определению мутации гена KRAS методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В зависимости от процентного содержания опухолевых клеток в образце для экстракции ДНК проводили 3-5 макродиссекций и депарафинизацию. Во избежание получения ложноотрицательных результатов образцы, содержащие менее 20% опухолевых клеток, подвергали микродиссекции по заранее отмеченной морфологом зоне слайдов. Экстракцию ДНК проводили, используя коммерческие наборы (FFPE DNA extraction kit, Qiagen). Концентрацию экстрагированной ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop, качество ДНК оценивали с помощью постановки контрольной ПЦР в режиме реального времени, сравнивая с контрольной ДНК (входит в состав в коммерческого набора). KRAS-тест проводили, используя коммерческие наборы BioLink (Россия) для выявления мутаций в 12-м и 13-м кодонах экзона 2 аллель-специфичным ПЦР-методом. Статистическая обработка материала производилась на персональном компьютере, в программе математической обработки данных пакета IBM SPSS Statistics 20 (trial-версия). Результаты исследования При исследовании 332 образцов опухолей больных КРР в 183 (55,1%) случаях выявлен дикий тип, а у 149 (44,9%) больных обнаружена мутация гена KRAS в экзонах 12 и 13 (табл. 1). ps202001.4el00081.jpg Из выявленных 149 мутаций наиболее часто (80,5%) мутации гена KRAS обнаруживались в кодоне 12 в экзоне 2, в 29 (19,5%) образцах мутации выявлялись в кодоне 13 в экзоне 2 (табл. 2). Из табл. 2 следует, что четкой зависимости частоты мутации гена KRAS у больных КРР от региона их проживания не установлено. Для пары «регион проживания - все KRAS-мутации» значение коэффициента корреляции rp = 0,1 (р = 0,05). Для пары «регион проживания - G12A-мутация» значение коэффициента корреляции rp = 0,1 (р = 0,05), отмечается связь очень слабой силы между этими переменными. Для пары «регион проживания - G12С-мутация» значение коэффициента корреляции rp = 0,093 (р = 0,05). Корреляционная связь слабой силы отмечена между этими переменными. Для пары «регион проживания - G12D-мутация» значение коэффициента корреляции rp = 0,098 (р = 0,06), отмечена также связь очень слабой силы между переменными. Для пары «регион проживания - G12S-мутация» значение коэффициента корреляции rp = 0,103 (р = 0,06), получены схожие результаты корреляции с вышеуказанными данными. Для пары «регион проживания - G12V-мутация» значение коэффициента корреляции rp = 0,116 (р = 0,05), для пары «регион проживания - G13D-мутация» значение коэффициента корреляции rp = 0,072 (р = 0,05). Практически для всех видов мутации не установлено зависимости от места проживания. Среди выявленных мутаций наиболее частой (48 из 149 больных) оказалась замена аминокислоты глицина на аспартат в 12-м кодоне (Gly12Asp). Далее по частоте мутации расположились следующим образом: Gly12Val - 37 (24,8%), Gly13Asp - 29 (19,5%), Gly12Ala - 20 (13,4%), Gly12Ser - 8 (5,4%) и Gly12Сys - 7 (4,7%). В исследовании из 332 образцов опухолей в 183 случаях (55,1%) выявлен дикий тип гена KRAS. Последние результаты исследований показали, что мутация является причиной резистентности к анти-EGFR терапии приблизительно в 35-40% случаев КРР. Определение дикого типа гена позволяет выделить новую подгруппу больных КРР, которым показано проведение таргетной терапии препаратами анти-EGFR. При изучении встречаемости дикого типа гена KRAS у больных в различных областях республики показано, что наиболее часто (более 50%) дикий тип гена обнаружен в Южно-Казахстанской (71,4%), Карагандинской (65,5%), Восточно-Казахстанской (55,3%), Павлодарской (55,6%) областях и в г. Алматы (60,7%). Нами оценена встречаемость мутации в 12-м и 13-м кодонах гена KRAS у больных КРР по различным областям Республики Казахстан. Наибольшие значения этого показателя установлены в Алматинской (76,5%), Кызыл-Ординской (60%), Костанайской (52,4%) и Северо-Казахстанской (58,3%) областях. Низкая частота мутированного типа встречалась в Южно-Казахстанской (28,6%) и Карагандинской (34,5%) областях. Установлено, что при КРР почти 90% всех нарушений представляют собой точечные замены одного нуклеотида на другой во втором экзоне генов KRAS и NRAS, в последовательностях, кодирующих 12-ю и 13-ю аминокислоты. В норме в обеих позициях располагается глицин, единственная аминокислота, не имеющая боковой цепи. Любое изменение этой последовательности приводит к замене глицина на разветвленные аминокислоты, что ведет к нарушению пространственной конформации протеина. Нами проведено определение наиболее распространенных мутаций по областям Республики в 12-м и 13-м кодонах: G12C, G12S, G12V, G12D, G12A и G13D. Изучение частоты встречаемости мутации G12A показало, что этот показатель в г. Алматы составил 35% случаев, в Алматинской области - 30%, в Карагандинской - 10%, в Северо-Казахстанской - 10%, в г. Астане, Восточно-Казахстанской и Мангыстауской областях - в 5% случаях. Мутация G12C встречалась реже, и по разным областям Республики этот показатель составил в г. Алматы - 42,9% случаев, Костанайской области - 28,6%, Северо-Казахстанской - 14,3%, Южно-Казахстанской - 14,3% случаев. Среди всех изученных мутаций гена KRAS наиболее часто встречаемая в кодоне 12 - G12D. При анализе встречаемости наибольшие показатели мутации гена G12D зафиксированы в г. Алматы в 17 (35,4%) случаях, в Восточно-Казахстанской области - в 6 (12,5%), в г. Астана - в 5 (10,4%), в Алматинской области - в 5 (10,4%); по частоте до 10% случаев - в Костанайской области (4; 8,3%), Карагандинской (4; 3%), Северо-Казахстанской (3; 6,3%), Павлодарской (2; 4,2%), Южно-Казахстанской (1; 2,1%) и Актюбинской (1; 2,1%). Наиболее редкой мутацией явилась G12S, она встречалась у больных КРР следующих регионов: г. Алматы (3; 37,5%), Восточно-Казахстанской области (2; 25,0%), г. Астаны (1; 12,5%), Карагандинской области (1; 12,5%) и Павлодарской области (1; 12,5%). Мутация G12V, т. е. замена аминокислоты глицин на валин, встречалась чаще, чем другие замены в аминокислотном составе. Наличие данной мутации отмечено во всех областях республики: в г. Алматы (22; 59,5%) случаев, г. Астана (2; 5,4%), в Алматинской (2; 5,4%), Костанайской (2; 5,4 %), Карагандинской (2; 5,4%), Жамбылской (2; 5,4%), Восточно-Казахстанской (1; 2,7%), Северо-Казахстанской (1; 2,7%), Кызыл-Ординской (1; 2,7%), Актюбинской (1; 2,7%) и Мангыстауской (1; 2,7%) областях. Несмотря на то что мутация в 13-м кодоне встречается реже (в 4 раза), чем в 12-м кодоне, нашей целью также было изучение ее встречаемости у больных КРР Республики Казахстан. Наибольшие показатели мутации G13D обнаружены в г. Астана (8; 27,6%) случаев, Восточно-Казахстанской области (7; 24,1%), г. Алматы (5; 17,2%), Костанайской (3; 10,3%), Южно-Казахстанской (2; 6,9%), Кызыл-Ординской (2; 6,9%) и Павлодарской (4; 2,7%) областях. Согласно данным разных клинических исследований, мутации гена KRAS в опухолях КРР различных популяций вариабельны и встречаются в 30-60% случаев [8-10]. Например, у афроамериканцев частота мутаций в гене KRAS составляет 30,9% (n=222), у японцев - 37,6% (n=5790), у немцев - 49% (n=820). Нами установлено, что частота мутации гена KRAS в Республике Казахстан составила 44,9% (n=332). Полученные данные указывают на то, что частота встречаемости мутации гена KRAS у больных КРР в различных областях республики была неравнозначной: в Алматинской, Кызыл-Ординской, Северно-Казахстанской областях частота мутации встречалась более чем в 50% случаях, тогда как дикий тип гена KRAS наиболее часто обнаруживался в Карагандинской (65,5%), Южно-Казахстанской (71,4%) областях и г. Алматы (60,7%). В проведенном исследовании опухолей с мутированным типом гена KRAS (n=149) преобладающим типом точечной мутаций оказались G12D (32,2%), G12V (24,8%) и G13D (19,5%) в 12-м и 13-м кодонах. Точечная мутация - это тип мутации в ДНК или РНК, для которого характерна замена одного азотистого основания другим. Точечные мутации замены оснований классифицируют на транзиции и трансверсии. Транзиция - это замена одного пуринового основания на другое (аденин на гуанин или наоборот) либо аналогичная замена пиримидиновых оснований (тимин с цитозином). Трансверсия - это замена пуринового основания на пиримидиновое или наоборот. В точечной мутации транзиции происходят чаще, чем трансверсии [11]. Результатами многих исследований доказано, что наиболее часто встречающимися точечными мутациями при КРР являются транзиции (мутации G12D и G13D) с результирующей заменой глицина на аспарагиновую кислоту в белковой последовательности. В Республики Казахстан среди больных КРР мутации G12D и G13D также встречаются чаще других, но, в отличие от установленных данных, нами обнаружена частая мутация G12V, т. е. замена глицина на валин. Известный факт, что транзиции могут происходить спонтанно в результате ошибок репликации ДНК под действием пищевых, генотоксических агентов и химических модификаций азотистых оснований [9]. В настоящее время проводится ряд исследований для определения факторов, влияющих на возникновение точечной мутации. В нашем исследовании не прослеживается четкой зависимости частоты мутации гена KRAS у больных КРР в зависимости от региона проживания. На основании данных ряда источников литературы, подтверждающих высокую частоту мутации гена KRAS при КРР в зависимости от локализации опухоли (чаще в дистальных отделах толстой кишки и прямой кишке) и наличия метастатических пораженных лимфатических узлов, можно предположить, что в указанных областях превалировали больные именно с такими же характеристиками. По данным клинических исследований показано, что наличие мутации KRAS является причиной резистентности к анти-EGFR терапии приблизительно в 35-40% случаев заболевания. Определение дикого типа гена позволяет выделить новую подгруппу пациентов, которым показано проведение таргетной терапии препаратами анти-EGFR. При проведении подсчета случаев встречаемости дикого типа по Республике Казахстан установлено, что число больных, нуждающихся в таргетной анти-EGFR терапии (метастатические формы) составило 55,1%, что не противоречит данным, полученным исследователями других стран. Заключение На основании проведенного исследования установлено, что четкой зависимости частоты мутации гена KRAS у больных КРР от региона их проживания нет. Высокая частота встречаемости мутированного типа гена (58,3-76,5% случаев) выявлена в трех областях Республики: Кызыл-Ординской, Северо-Казахстанской и Алматинской. Дикий тип гена KRAS наиболее часто обнаруживали у больных Карагандинской области (65,5%), Южно-Казахстанской (71,4%) и г. Алматы (60,7%). При оценке частоты случаев встречаемости дикого типа в Республике Казахстан показано, что число больных, нуждающихся в таргетной терапии с ТКИ EGFR (метастатические формы) составило 55,1%. В Республике Казахстан нами впервые определена частота мутаций гена KRAS у больных КРР (44,9%), которая близка по своему значению к мировым показателям (~40%). Из этого следует, что такие пациенты нуждаются в определении статуса мутаций гена KRAS, играющего важную роль в определении стратегии лекарственного лечения. Исследование не имело спонсорской поддержки. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

K. K. Smagulova

The Kazakhstan Research Institute of Oncology and Radiology

Email: akaldygul@mail.ru

D. R. Kaydarova

The Kazakhstan Research Institute of Oncology and Radiology

T. S. Nasrytdinov

The Kazakhstan Research Institute of Oncology and Radiology

References

Statistics